1532年底，在打败苏莱曼一世的进攻后，卡尔五世返回西班牙，准备从那里开启对奥斯曼土耳其人的“十字军东征”（圣战，Kreuzzug）。战争尚未开始，法国国王弗朗索瓦一世便在1534年与柏柏尔人（Barbaresken）和土耳其人结盟，从东西两向、海陆两面向哈布斯堡王朝发起了进攻。罗马教皇克雷芒七世乘机串通法国，暗中打击皇帝在意大利的势力。英国国王亨利八世因为正在与阿拉贡的卡塔琳娜（Catalinade Aragón）闹离婚，故而转向了法国一边。

1535年6月15日，卡尔五世亲自统帅军队从西班牙出发登陆北非，攻占拉古莱特（La Goletta或La Goulatte）和突尼斯（Tunes或Tunis），取得了轰动全欧洲的胜利。克雷芒七世早在1534年9月25日就去世（大概是被毒死的）了，卡尔五世凯旋罗马，受到新任教皇保罗三世（Paul III.，1468—1549）的隆重接待。只是柏柏尔人的势力并没有被全部消灭。

1535年11月1日，米兰公爵弗朗切斯科·斯福扎去世，斯福扎家族绝嗣。卡尔五世将米兰变为帝国采邑，并将它授予自己的儿子腓力（Felipe，1527—1598）。法国国王弗朗索瓦一世重整军备，再次进军意大利，并在1536年4月2日以突然袭击的方式夺取了萨伏伊和都灵公国。4月17日，卡尔五世亲赴梵蒂冈向教皇和枢机主教控诉弗朗索瓦一世屡次毁约的不义之举，要求与他进行骑士式决斗。为了迎合枢机主教集团中的改革派，他也提出了通过召开大公会议解决宗教纠纷的主张。但在随后的普罗旺斯和尼德兰战争中，卡尔五世并没有取得重大成果。弗朗索瓦一世也未实现修正《康布雷条约》的目标。

卡尔五世固执地坚持从海陆两面对土耳其人发动大规模征伐计划。为此，他在1538年2月8日同教皇和威尼斯结成反土耳其的攻守同盟。但未过多久，威尼斯就单独与土耳其人媾和，卡尔五世构建的同盟瓦解，其征伐计划也未付诸实施。6月18日，在教皇保罗三世的调解下，卡尔五世与弗朗索瓦一世在尼斯（Nizza）签订了为期10年的停战协议，规定在意大利维持现状（Status quo）。弗朗索瓦一世虽然签署了停战协议，却未中断与土耳其人的勾结。不仅如此，他还积极与神圣罗马帝国的福音教等级进行联系，力图建立广泛的反哈布斯堡联盟。

在匈牙利，费迪南也只能保有一小部分国土。鉴于土耳其人入侵的危险，他在1538年与扎波利亚缔结《格罗斯瓦尔戴因条约》（Vertrag von Growardein），承认扎波利亚为他所统治地区的匈牙利国王，只是在扎波利亚去世后，费迪南才有权接管这一地区。哈布斯堡家族的东扩计划面临种种困难，而要克服这些困难，费迪南必须倾其所有力量。这样一来，他在处理神圣罗马帝国事务方面，也是心有余而力不足了。

鉴于法国和土耳其的威胁，卡尔五世不得不在宗教问题上继续采取调停政策。他在1539年4月10日与施马尔卡尔登同盟缔结《法兰克福宗教和约》（Frankfurter Anstand），重申《纽伦贝格宗教和约》的各项规定，确保福音教徒的财产占有状况。他也在福音教帝国等级作出不再没收教会财产、不再扩大施马尔卡尔登同盟的承诺的前提下，放弃了接受新成员加入天主教纽伦贝格同盟的要求。除此之外，卡尔五世还按照对各种信纲持中立态度的勃兰登堡选侯约阿希姆二世（Joachim II.，1505—1571）的建议，举行宗教会谈，调解各方矛盾。1540年，福音教和天主教神学家及世俗官员在哈格瑙（Hagenau）和沃姆斯（Worms）举行宗教对话，虽未取得重大成果，但也在一些神学争论点上达成了妥协性表述。

1541年4月5日，帝国等级会议在雷根斯堡召开。卡尔五世亲临现场进行斡旋。新旧两教有名望的神学家在沃姆斯宗教对话的基础上，就教会统一问题进行了热烈讨论。会谈起初还比较顺利，双方对于因信称义教义的看法基本接近，在幕后活动中的教皇使节、改革派枢机主教集团首领加斯帕罗·孔塔里尼（Gasparo Contarini，1483—1542）也准备认可教士结婚主张和教徒饼酒同领的圣餐仪式。但到最后，在有关教皇的宗教权威、实体转化等问题上双方仍各执一端，虽然签署了《雷根斯堡文书》，但遭到福音教和天主教帝国等级的普遍反对；路德和罗马教皇也予以拒绝。卡尔五世忙于出征，无暇他顾，只给福音教徒一道临时敕令，再一次延长《纽伦贝格宗教和约》的有效期。

1542年，科伦大主教赫尔曼·冯·维德公然宣称放弃天主教，改信福音教，并在布塞尔和梅兰希通的帮助下实施了福音教制度，将科伦大主教辖区改变为世俗的福音教公国。因为科伦大主教的改宗将使选侯集团内部的教派比例发生不利于天主教方面的变化，所以教皇、皇帝和其他天主教势力都不能容忍，决心倾力干预。罗马教皇保罗三世宣布开除维德教籍、褫夺其科伦大主教职位，皇帝卡尔五世也宣布了帝国放逐令。施马尔卡尔登同盟内部意见不一，未能给予任何支持。迫于压力，维德不得不在1547年2月25日辞职还乡，以务农为生，直至1552年8月15日去世。

与此同时，法国国王弗朗索瓦一世又开始进行密集的外交活动、为新的战争做准备了。而出使伊斯坦布尔（I·stanbul）的法国公使在返途被西班牙士兵杀害一事发生后，形势遽然紧张起来。卡尔五世虽然极力否认他与此事有关，但他事先知情的事实却难以遮掩。当奥斯曼土耳其人对费迪南统治下的匈牙利发起新一轮进攻时，卡尔五世没有派军队直接到前线增援，而是在1541年10月派遣舰队远征阿尔及尔（Algier），结果遭到秋季风暴，无功而返。次年，费迪南进军匈牙利，但在抵达奥芬城时，军队哗变，军事行动半途而废。

1543年，弗朗索瓦一世联合奥斯曼、丹麦、瑞典、苏格兰诸国以及神圣罗马帝国的于利希—克累弗—贝格公国等多方势力一起对卡尔五世宣战，但因丹麦、瑞典和苏格兰中途退出联盟，故而未对皇帝造成多大威胁。卡尔五世却乘机对克累弗（Kleve）公国发起攻击，摧毁迪伦（Düren），占领楚特芬（Zutphen）和格尔德恩（Geldern）两公国，并迫使于利希—克累弗—贝格公爵威廉五世（Weilhelm V. ，1516—1592）签署《芬洛条约》（Vertrag von Venlo），把楚特芬和格尔德恩两邦土地从帝国中分割出来归并入尼德兰，亦即皇帝本人的领地。威廉公爵还被迫向皇帝作出不实行宗教改革的保证。

在1544年的施佩耶尔帝国等级会议上，卡尔五世呼吁帝国等级联合起来抗击法国入侵，后者第一次，也是唯一一次全体响应皇帝的号召，参加对法国的战争，但也向皇帝提出了很高的要求：停止帝国最高法院审理宗教诉讼案件，从帝国法律上承认《奥格斯堡信纲》。卡尔五世坚持由下一届宗教会议或帝国等级会议作出决定，届时，允许路德派充分阐述自己的意见。教皇对皇帝的妥协提出了严厉批评，他不希望路德和加尔文获得皇帝的保护。在帝国等级军队的协助下，卡尔五世迅速侵入法国，虽未能突破坚固的防线，但还是在9月18日迫使弗朗索瓦一世签订《克雷皮和约》（Vertrag von Crepy），重申以往的停战协议，责令弗朗索瓦一世放弃对拿不勒斯、佛兰德和阿图瓦的领土要求以及与神圣罗马帝国福音教等级的结盟。弗朗索瓦一世还被迫答应出兵1万人，协助卡尔五世对土耳其人的战争，承诺派代表参加即将在特伦托召开的大公会议。